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ELISA實驗結(jié)果不理想、應(yīng)注意哪些要點
優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號。而不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來不理想的結(jié)果。
在做ELISA實驗時，洗板有兩種方法：手工法洗板 和 洗板機(jī)洗板。二者沒有本質(zhì)的差別，只要操作合乎要求，均能得到正確、可靠的結(jié)果。
手工洗板：
手工洗板人為因素比較大，實驗人員必須經(jīng)驗豐富，洗滌次數(shù)要足夠，沖擊力又不要太大，加入的洗液量以說明書為準(zhǔn)，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈，同時防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要，否則易造成假陽性。每次洗完板后，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時要垂直，避免交叉感染。用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用，應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結(jié)合物不耐干燥，特別在較高的溫度下更易失活，所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時間，時間越長，吸光度值越低。
手工操作有 浸泡式 和 流水沖洗式 兩種方法：
浸泡式
1. 吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液;
2. 用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后，即甩去);
3. 浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短;
4. 吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;
5. 重復(fù)操作步驟3和4，洗滌3～4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
流水沖洗式
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為，且也簡便、快速。
已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。
洗板機(jī)洗板：
洗板機(jī)洗板人為因素少，速度快，條件恒定，但是使用洗板機(jī)洗板時應(yīng)注意以下三個關(guān)鍵點。
洗滌參數(shù)
主要的參數(shù)是洗滌量。自動洗板機(jī)會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。
ELISA試劑盒的使用手冊中有列出洗滌量。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數(shù)
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量。當(dāng)然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強(qiáng)度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過，有些自動化洗板機(jī)可設(shè)置程序，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢?其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中。
抽 吸
還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景(殘留量)和差異。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。
吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。
目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜，因為你需要非常仔細(xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見，因為更快)，那么抽吸的位置需要優(yōu)化。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。
洗板時注意事項：
1. 需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2 μl。
2. 及時更換破損吸液針，避免破壞底板包被。
3. 針對不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板。
4. 注意調(diào)整洗液量，洗液量過多將溢出，過少將達(dá)不到洗滌效果。
5. 關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道。
4. 不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。
為了洗滌效果較好，實驗室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1～2次，能達(dá)到理想的洗滌效果。ELISA看起來很簡單，但是在實際操作過程中，絕不能掉以輕心，除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實驗操作，高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證!
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